色谱柱是高效液相色谱仪最主要的部件，被测物质能否被很好的分离和测定，色谱柱的性能起着决定性的作用，因此，应特别注意色谱柱的活化环节，此外色谱柱的日常维护也很重要，有效地维护可以延长色谱柱的使用寿命。

液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱;反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团(ODS)称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。

色谱柱的活化

新的液相色谱柱都是保存在一定的保存液中的，所谓的活化就是替换掉其中的保存液，冲洗掉柱中可能残留的其他杂质，以免影响后续分析工作。液相色谱柱的活化方法因柱子而异。

反相色谱柱：使用新的C18柱时，先用甲醇或乙-腈冲洗20-30个柱体积，然后用甲醇/乙-腈：水(50:50)冲洗10个柱体积，然后再用流动相平衡10-30柱体积。

正相色谱柱：新柱用流动相平衡20-30个柱体积。

离子色谱柱(SAX, SCX)：新柱先用100%甲醇或乙-腈冲洗20个柱体积，然后转换到流动相平衡。

不同的色谱柱活化的方法不尽相同，要根据柱子的种类来选择活化方法。另外，要提醒的是，柱子活化时不要接检测器，避免不必要的污染。

液相色谱柱的维护

色谱柱的维护有一定的程序：色谱柱的平衡、色谱柱的再生、最后才是色谱柱的维护。

1、色谱柱的平衡

反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!

操作步骤：

a. 平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡)

b. 如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡; 分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。

2、色谱柱的再生

长期使用的色谱柱，往往柱效会下降(柱子的理论塔板数减低)。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。

选择再生方法：

极性固定相(如Si，NH2* ，DIOL基色谱填料)的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水。非极性固定相(如反相色谱填料RP-18，RP-8，CN等)的再生：水→乙腈→氯仿(或异丙醇)→乙腈→水。

注意：

a. 在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

b. 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

3、色谱柱的维护

a.使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度);

b.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围;

c.避免流动相组成及极性的剧烈变化;

d.流动相使用前必须经脱气和过滤处理;

e.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中;

f.氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

液相色谱柱的使用注意事项

液相色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意液相色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10%左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。

1、流动相

流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm 的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。

但如果您实验室中同时有液质与液相的话，建议液质的流动相不要轻易过膜，容易出现交叉污染，或者液质使用专门的过膜仪器。

液相与液质混用过膜装置，导致三乙胺进入质谱，响应突然下降。

以常规硅胶为基质的键合相填料通常的pH值适用范围是2.0-8.0。当必须要在pH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。

不同填料的色谱柱，PH、柱温的范围是不一样的。

2、样品

样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱(spe)对样品进行预处理;若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。

一般样品高速离心就可以了，但需注意取上清时，不要取到下面的沉淀物质以及色谱柱前最好加装 预柱或在线过滤器。

3、反相液相色谱柱色谱柱每天实验后的保养

使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。

4、长期保存色谱柱

如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。

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