1. 流动相的准备。按照分析方法配制或准备流动相，用0.45μm微孔滤膜过滤后，超声脱气5分钟。将流动相放置在液相色谱溶剂盘中, 将A、B、C泵吸液管分别放入甲醇、超纯水和缓冲盐溶剂瓶底部。
2. 开机。在仪器背面从上到下依次打开泵、进样器、柱温箱和检测器单元的电源开关，打开电脑，等待约1～2分钟，变色龙服务管理器将会自动启动(或双击电脑右下角的变色龙软件的服务管理器，点击“启动仪器控制器”激活服务管理器)。双击电脑桌面的“Chromeleon 7”图标，进入变色龙软件。
3. 管路排气。向上掀开最上层泵单元前面板，拧松金黄色快速清洗阀(逆时针两圈左右)，在软件中设置A通道比例为100%(其他通道比例设置为0), 然后点击“冲洗”，泵将以3.0mL/min的速度自动快速冲洗泵管内残留的气体，2min后将自动停止，观察流动相应连续、无气泡。同样设置需要使用的B、C泵通道比例为100%进行管路冲洗排气，冲洗结束停泵后，关闭(拧紧)清洗阀。
4. 运行仪器。点击"Pump module"，设置流速1.0mL/min，设置流动相A:C=40:60(设置C通道为60%)，点击“马达”启动泵。点击“UV”，设置波长230nm，点击“氘灯”打开光源。
5. 创建方法。在“创建”菜单中点击“仪器方法”，设定运行时间5min，在“诊断通道”项下点击“取消选择所有通道”，点击下一步。pump常规设置按默认值，点击下一步。在pump流速梯度窗口，点击“删除平衡阶段”，设置流速为1.0mL/min，流动相A:C=40:60，点击下一步。Sampler常规设置按默认值，点击下一步，进样模式按默认值，点击下一步。在温度控制窗口，不设直接点击下一步。在UV通道窗口，设置1通道波长为230nm即可，点击下一步直至完成。点击左上角“保存”，将方法保存在Chromeleon 7下班级名称文件夹中，以组号及测定物质名称命名。
6. 创建处理方法。在“创建”菜单中点击“处理方法”，选择基本定量，点击下一步，输入方法名称并保存至班级文件夹下，点击完成。
7. 创建序列。在“创建”菜单中点击“序列”，在进样名称的格式栏中输入样品名称(苯甲酸标准或果汁样品)，样品数设2，进样次数设1，开始位置RA1，进样量设20uL，点击下一步。点击浏览，选择前面所建立的仪器方法和处理方法，用作新建样品序列的分析。点击下一步，输入序列名称并保存至班级文件夹下，点击完成。
8. 测定。在自动进样器红色样品盘中的RA1和RA2位置分别放入标准和样品溶液瓶。在左侧导航区下方点击仪器，点击工具栏的“监视基线”，在弹出的“选择监视通道”窗口勾选所需的监视波长和通道，待基线平稳后，点击“自动校零”，点击工具栏的“停止”，停止基线采集。在左侧导航区下方点击数据(或选中新创建的序列)，按照实际放入样品盘的待测溶液修改样品名称和类型(1号为标准，2号为样品)，点击“开始”，系统自动按顺序进样分析。如需添加样品，可点击“单击这里可添加新的进样”。
9. 记录数据。在左侧导航区下方点击数据，打开刚运行的序列，双击序列数据表格第一列UV下方对应的色谱图，记录目标峰的保留时间和峰面积，如自动积分不正确，可利用手动积分删除峰，再进行手动积分处理。
10. 关机。分析结束后，关紫外灯。如流动相中含有缓冲盐，则设置流动相甲醇:水=5:95，冲洗色谱柱30min，然后用100%甲醇冲洗30min。停泵，关闭软件，从下到上依次关闭各单元电源，关闭计算机，填写仪器使用记录。
高效液相色谱仪的日常维护保养
1. 保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期清洗;用试剂瓶作贮液瓶时，要经常更换。定期(如半个月)在稀硝酸溶液中超声、清洗过滤器，保持过滤器畅通无阻。
2. 使用HPLC试剂和新蒸二次蒸馏水作流动相，所使用的溶剂其截止波长一定要低于检测波长，对不是HPLC级的试剂要进行过滤(HPLC试剂出厂前已用0.02μm滤膜过滤)。对流动相一定要脱气。
3. 流动相使用不要超过两天，尤其是夏天，最好每天新鲜配制以免微生物的生长。腐蚀性溶剂或缓冲液在泵内存放不可过夜，否则溶剂会对泵起腐蚀作用。使用腐蚀性物质后要冲洗，先用水后用甲醇。
4. 每天开始使用仪器，注意放空排气，确保泵头、流动池以及其它流路系统中无气泡存在。
5. 珍惜保护色谱柱，避免柱头突然产生大的波动，扰动损伤柱床。如避免泵启动过速、升压过快、样品阀搬动过慢所造成的柱压大的波动。
6. 采用保护(警戒)柱，延长柱寿命。如污染物堆积于保护柱柱头，造成柱压升高，柱效下降，峰形变差时，卸下用强溶剂反冲后再用或更换新保护柱。
7. 避免超负荷进样，对250×4.6mm的柱子,绝对进样量应不超过100μg。在灵敏度允许的前提下，应尽量将试样浓度降低，减少绝对进样量(进样体积可保持不变)，这是保持HPLC柱性能持久良好的重要举措之一。
8. 经常用强溶剂冲洗柱子，将柱内强保留组分及时洗脱出。反相柱用异丙醇--二氯甲烷(1：1)冲洗，正相(硅胶柱)用纯甲醇或异丙醇冲洗，时间均不少于1h。
9. 做完试验，及时用适当溶剂冲洗柱子和进样阀，尤其是对过夜的柱子和进样阀，一定要用足量的水彻底洗净其中的盐类、缓冲液，再用甲醇或乙腈冲洗，并保存在乙腈(或甲醇)中。正相柱保存在非极性有机溶剂(如己烷)中。含盐流动相的冲洗方法：每天操作结束后，先用纯化水或含甲醇5%的水冲洗时间约20～30分钟，再用纯甲醇冲洗约30～60分钟(注：不能直接用有机溶液冲洗，盐类易析出，堵塞色谱柱，造成色谱柱永久性损坏;所用水最好是重蒸馏的水，必须抽滤和脱气)。不含盐的流动相冲洗方法：每天操作结束后，先用流动相冲洗约10～15分钟，再用含5%甲醇的水冲洗10～20分钟，最后用纯甲醇冲洗，时间约20～30分钟(注：不能直接用纯水冲洗，易造成流动停止)。
10. 以硅胶为基质的柱子，如C-18、C-8等，要控制好流动相的pH值，一般不要低于2.5，不高于7.0。pH>8会使硅胶骨架溶解;pH<2则键合相化学键易剥离。
11. 尽量用流动相溶解样品，一是避免出现拖尾峰、怪峰，二是避免试样在系统中由于溶解度降低而析出。
12. 用HPLC分析酸碱性物质，由于吸附作用(次级保留)使峰形拖尾。加入改良剂可以大大改善峰形，提高积分的准确度。一般规则是：①分析酸性物质，可加入1%有醋酸;②分析碱性物质，可加入10-20mmol/L三乙胺;③酸碱物质混为一体，可同时加入1%的醋酸和10-20mmol/L三乙胺。
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